Plísně jsou eukaryotní, heterotrofní, mnohobuněčné vláknité mikroorganismy, jejichž stélku tvoří vlákna (hyfy), která mohou být přehrádkovaná i nepřehrádkovaná, jejich spleť označujeme jako mycelium (vzdušné, substrátové).

Výskyt plísní v potravinářství je až na malé výjimky, kdy se používají jako čisté kultury, nežádoucí. Plísně jsou nenáročné na životní podmínky: jsou schopné využívat vzdušnou vlhkost, rostou i za nízkých teplot, snáší vyšší osmotické tlaky, rostou v kyselém prostředí a mají obrovskou rozmnožovací schopnost.

Správná diagnostika plísní spočívá v použití standardních živných půd, správné kultivaci a kvalitní přípravě mikroskopického preparátu. Běžně se plísně kultivují na sladinovém agaru, nebo na Czapek-Doxově agaru. Při kvantitativním hodnocení předepisují normy arbitrážní agarové půdy s antibiotiky. Použitá živná půda výrazně ovlivňuje sporulaci. Sporuluje-li kultura špatně, pěstujeme ji na půdách obohacených o přirozené složky (chléb, zelenina, ovoce, části rostlin). Přesto často kultury při opakovaném očkování na umělých agarových půdách schopnost sporulace ztrácejí. Klíčivost spor je malá. Kultury je nutno alespoň 1x za 3 měsíce přeočkovat.

Odlišení plísní od bakterií a kvasinek je velmi snadné. Mycelium plísní je dobře rozlišitelné pouhým okem. Při určování musíme pracovat s monokulturou. Pokud v tomto případě máme pochybnosti, provádíme izolaci. V běžné praxi můžeme určovat vícesporickou kulturu. Tedy takovou, která vznikla z více spor jednoho druhu (např. očkujeme-li kapkou nebo očkovací jehlou). Pro přesné práce, např. v genetice nebo taxonomii, musí být kultura monosporická. Nejčastěji se monosporická izolace provádí ředěním suspenze spor a jejich postupným očkováním na vhodné živné půdy. Suspenzi spor je nutno ředit tak, aby během kultivace vyrostlo na Petriho misce kolem 10 kolonií. Při větším počtu by vzhledem k velkým rozměrům kolonií byla malá pravděpodobnost, že z jedné buňky vyroste jedna kolonie. Kultivujeme při 25 °C 5 – 7 dní.

Pro základní orientaci při určování plísní většinou stačí určit makroskopické a mikroskopické vlastnosti (znaky).

Jedná se o kultivační vyšetření. Pozorujeme vzhled, barvu a vlastnosti kolonií. Je nutné si uvědomit, že na různých živných půdách se může vzhled kolonií lišit. Často používáme při posuzování habitu (vzhledu) kolonií neznámých plísní srovnávací materiál, např. sbírkové kultury, nebo trvalé preparáty.

Na vzhled mycelia a rychlost růstu může mít vliv také kultivační teplota. Základní kultivační teplota je 20 – 25 °C. Někdy, podle povahy izolátu, kultivujeme navíc ještě při teplotách 15 °C a 37 °C. Vzhled mycelia se často mění v závislosti na čase. Proto jej posuzujeme na začátku a v době plné sporulace. Hodnotíme substrátové mycelium (barva, okraje, výška, uvolňování pigmentů) a vzdušné mycelium (barva, hustota, charakter porostu, kapky vody). Důležité je rovněž zjišťování útvarů viditelných pouhým okem (sklerocia, sporangia, koremia apod.).

Z makroskopických znaků hodnotíme především:

Kromě běžných morfologických vlastností, jako je šířka a větvení mycelia, tvorba přehrádek apod. nás nejvíce zajímá způsob rozmnožování (pohlavní a nepohlavní) a vlastnosti spor (tvar, velikost, vlastnosti povrchu), určují se vzhledové vlastnosti fruktifikačních orgánů.

Vyšetření provádíme pomocí nativních nebo polotrvalých preparátů a sklíčkových kultur. Jako uzavírací médium můžeme použít fyziologický roztok, 10 – 20% glycerol, kyselinu mléčnou nebo laktofenol.

Tato jednoduchá metoda nám umožňuje sledovat mycelium v neporušeném stavu. Nevýhodou je pozorování horních částí mycelia, zhoršené prosvětlování a zaostřování.

Petriho misku s narostlou kulturou umístíme na stolek mikroskopu a pozorujeme při nejnižším zvětšení. Postupně proostřujeme struktury vzdušného mycelia. Nejlépe se mikroskopují okraje kolonií.

Princip:

Při tvorbě nativního preparátu fyziologický roztok nahrazujeme laktofenolem, který preparát zároveň fixuje. Laktofenol (směs kys. mléčné, glycerolu, fenolu) dobře smáčí hyfy, konzervuje, pomalu vysychá, hyfy nebobtnají, pro lepší rozlišení se dá obarvit methylenovou modří. Zdařilé laktofenolové preparáty můžeme vhodným lakem (acetonový lak, syntetický lak) zarámovat a vytvořit trvalý preparát.

Postup:

Do kapky laktofenolu na podložním skle se sterilními preparačními jehlami přenese opatrně malá část mycelia a šetrně se rozprostře, tak aby při přenosu nedošlo k rozbití útvarů a mechanickému poškození. Pokud se nám nedaří odebrat pouze mycelium, odebíráme kulturu i s částí agaru, který pak na sklíčku oddělíme a opatrně odstraníme. Opatrně překryjeme krycím sklíčkem, tak aby se nevytvořily bublinky, přebytečný laktofenol odsajeme filtračním papírkem. Pozorujeme nejdříve při malém zvětšení, pak při zvětšení 45x. Pozorované útvary zakreslíme a popíšeme.

Hodnocení:

Hodnotíme typ mycelia (přehrádkované, nepřehrádkované, tloušťka a barva hyf, způsob větvení), charakter fruktifikačních orgánů (konidiofor, sporangiofor, větvení, zakončení), přítomnost vegetativních fruktifikačních struktur (sporangium, kolumela, sporangiospory, sterigmata – primární, sekundární, konidie), přítomnost a charakter pohlavních fruktifikačních struktur (askus, askospory, zygospory), přítomnost zvláštních útvarů (chlamydospor, sklerocií, koremií, sporodochií, pyknid, stolonů, rhizoidů).

Jedná se o plísňovou kulturu vykultivovanou mezi podložním a krycím sklíčkem. Mycelium roste podél krycího sklíčka. Umožňují pozorování mycelia včetně všech struktur v přirozeném stavu, bez mechanického porušení.