Mikroskopický průkaz je jednou ze základních mikrobiologických metod. Výhodou je rychlost a nízké náklady, nevýhodou nízká citlivost.

Rutinně se používá optický mikroskop (využívá tok světla – fotonů), elektronový se využívá ke speciálním účelům na vyšších pracovištích (využívá tok elektronů).

Optika mikroskopu se skládá z okuláru a objektivu. Výsledné zvětšení, kterým se objekt pozoruje, je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru (např. objektiv 100x, okulár 10x = výsledné zvětšení 1000x).

Podle typu osvětlení se mikroskopie rozděluje na klasickou světelnou (zdroj bílé světlo – žárovka), zástin (pozorování v temném poli), metodu fázového kontrastu a fluorescenční (zdroj krátkovlnného záření xenonová výbojka). U fluorescenční metody je po styku s fluorochromy (barvivy) toto záření absorbováno a vyzářeno jako světlo viditelné).

Suchým optickým systémem lze pozorovat preparáty přibližně do zvětšení 500x. Pro větší zvětšení je nezbytné používat tzv. imerzní systém – na preparát se kápne imerzní olej a objektiv se do něj ponoří. Tím se sjednotí lom světla v prostředí vzduchu a skla.

Pro pozorování v mikroskopu je nutné připravit tzv. mikroskopický preparát.

Objekt se pozoruje v přirozeném stavu. Využívá se k pozorování především v parazitologii.

Objekt je na mikroskopické sklíčko fixovaný buď teplem, nebo chemicky a je obarven typem barvení podle účelu.

Barvení preparátů umožňuje sledování tvaru mikrobů, uspořádání, struktur bakteriálních buněk (spóry, pouzdra…), morfologických struktur eukaryot, zařazení mikroba do skupiny podle schopnosti se barvit.

Na podložní sklíčko se nanese suspenze mikroba (nejčastěji ve fyziologickém roztoku) a bakteriologickou kličkou se rozetře. Po uschnutí se fixuje protažením v plameni 3x, nebo chemicky např. přelitím metanolem.

Barvení podle Grama je základním barvením v mikrobiologii. Využívá se pro barvení bakterií a kvasinek. Rozděluje mikroorganismy do dvou základních skupin, které se liší stavbou buněčné stěny, na:

Buněčná stěna má jednodušší stavbu, je tvořená silnou vrstvou peptidoglykanu. Tato vrstva se obarví krystalovou violetí modrofialově a nelze ji odbarvit acetonem.

Buněčná stěna má složitější stavbu, je tenčí a skládá se ze dvou vrstev – vnější membrány a periplasmatického prostoru, ve kterém je uložen peptidoglykan. Tato vrstva se po obarvení krystalovou violetí a následném působení acetonu odbarví a následně dobarví karbolfuchsinem růžově, aby byla v mikroskopu viditelná.

Postup barvení:

Bakterie, jejichž buněčná stěna odpovídá stavbě grampozitivních bakterií, ale obsahuje hodně mastných kyselin a vosků, se Gramem barví obtížně nebo vůbec. Pro ně se využívá barvení podle Ziehla-Neelsena. Tyto bakterie se označují jako acidorezistentní, protože odolávají odbarvení kyselým alkoholem. Patří mezi ně především mykobakterie (původce tuberkulózy). Toto barvení se provádí standardně za tepla, ale je možné zvolit modifikaci postupu za studena. Výsledkem jsou růžovočervené mikroby na zeleném nebo modrém pozadí.

Postup barvení:

Využívá se modifikace – barvení podle Giemsa-Romanowski. Toto barvení umožňuje pozorování buněčných struktur. V mikrobiologii se využívá pro pozorování prvoků, pro hodnocení zastoupení jednotlivých druhů buněk v odebraném materiálu (leukocyty, epitelie…).

Tato metoda se využívá v mykologii při detekci dermatofyt. Louh (hydroxid) sodný KOH má schopnost projasnit tkáně. Šupiny kůže, nehty, vlasy se vloží do kapky 10–40 % KOH (ev. NaOH) na podložním skle, překryje se krycím sklíčkem. Po 30–60 minutách působení se přebytečný louh odsaje. Preparát se pak může obarvit různými technikami – kotonovou (bavlníkovou) modří, dle Grama, fluorescencí, …