8.2
Kvantitativní testy citlivosti
Kvantitativní testování citlivosti umožňuje hodnotit i stupeň citlivosti mikroba a zvolit tak pro léčbu nejvhodnější antibiotikum. Výsledkem testování je stanovení MIC minimální inhibiční koncentrace, což je nejvyšší ředění antibiotika (nejnižší koncentrace), které ještě zabrání růstu (inhibuje) mikroba. Kvantitativní stanovení citlivosti se používá u závažných nálezů, u kmenů s vyšší rezistencí a u komplikovaných pacientů. U některých antibiotik a dále u některých bakterií je to metoda volby.
8.2.1
Mikrodiluční metoda
Mikrodiluční metoda se provádí v plastových mikrotitračních destičkách, zpravidla komerčně dodávaných (96 jamek). Jamky jsou naplněné růstovým médiem (Mueller-Hinton bujon …), v každém sloupci obsahují jedno naředěné antibiotikum v 8 koncentracích v posloupném ředění s koeficientem 2 (0,125 – 0,25 – 0,5 – 1 – 2 – 4 – 8 – 16 – 32 – 64 – 128 …). V destičce je 12 sloupců, tedy 12 různých antibiotik pro jeden kmen. 1 jamka je vyhrazena pro kontrolu růstu, neobsahuje antibiotikum. Mikrodiluční metodu lze provádět i pomocí plně automatizovaných systémů.
Suspenze z kmene ve fyziologickém roztoku o hustotě 0,5 podle McFarlanda (108 CFU/ml) se naočkuje do všech jamek destičky pomocí jehlového inokulátoru nebo automatem. Kultivuje se 16–20 hod při 35±1 °C. Odečítá se v zrcátku nebo fotometrem, zakalená jamka znamená růst kmene, čirá jamka, že kmen je inhibován. MIC se pak rovná koncentraci antibiotika v první čiré jamce. Odečtená MIC se porovná s breakpointem.
- MIC ≤ BP mikrob citlivý
- MIC > BP mikrob rezistentní
+

Obr. 18. Odečítání mikrodiluční metody
8.2.2
E – testy (gradientové testy)
Tato metoda je nazvána podle slova epsilon, čti e-test. Princip stejný jako u mikrodiluční metody. Antibiotikum je napuštěno do papírového proužku v přesném gradientu koncentrace, hodnoty koncentrace jsou na proužku vyznačeny. Proužek se klade na půdu s naočkovanou suspenzí mikroba, podobně jako disky u diskového difúzního testu. Inhibiční zóna má vejčitý tvar, kde okraj zóny protne proužek, tam se odečítá hodnota MIC. Tato metoda je velmi přesná, ale ekonomicky nákladná. Využívá se pouze u závažných klinických stavů pacienta nebo tam, kde ostatní metody nejsou vhodné.
8.2.3
Stanovení minimální baktericidní koncentrace
MBC (minimální baktericidní koncentrace) je taková koncentrace antibiotika, která usmrtí všechny mikroby (nejen zastaví jejich růst). V praxi se tato metoda používá naprosto výjimečně.
8.2.4
Speciální metody stanovení citlivosti
8.2.4.1
Stanovení citlivosti mykobakterií
Vzhledem k velice dlouhé kultivační době nelze použít diskový difúzní test. Všechny metody stanovení citlivosti mykobakterií vycházejí z dilučních metod. Provádějí se buď na Löwensteinově půdě, v tekuté půdě v mikrotitrační destičce anebo v metabolickém kultivačním systému. Jednotlivé zkumavky obsahují antituberkulotika ve standardních kritických koncentracích, porovnává se růst v kontrolní zkumavce bez antituberkulotika s růstem ve zkumavkách s antituberkulotikem.
8.2.4.2
Stanovení citlivosti anaerobních bakterií
Stanovuje se mikrodiluční metodou nebo pomocí E-testů, vše v anaerobní atmosféře.
8.2.4.3
Stanovení citlivosti kvasinek a plísní
Používá se mikrodiluční metoda nebo E-testy.
8.2.5
Zjišťování typů rezistence na antibiotika
Některé bakterie vykazují specifické typy rezistence, které jsou epidemiologicky závažné a komplikují antibiotickou léčbu. Běžným testováním citlivosti se nemusí odhalit. Proto existují postupy, které jsou zaměřeny právě na detekci charakteristických variant rezistence. Jde o průkaz kultivačními technikami nebo detekcí příslušných mutací molekulárně-genetickými metodami.
8.2.5.1
Průkaz betalaktamáz neisserií, stafylokoků, hemofilů
Využívají se rychlé testy s chemickým průkazem enzymu. Jde o nitrocefinový test, při pozitivním průkazu betalaktamázy dojde ke změně barvy.
8.2.5.2
Průkaz širokospektrých betalaktamáz
ESBL Širokospektré betalaktamázy rozkládají betalaktamová antibiotika. Vyskytují se u některých kmenů všech druhů čeledi Enterobacteriaceae a jsou vázané na plazmid. Tyto kmeny bývají často rezistentní i k dalším druhům antibiotik jako např. aminoglykosidům, fluorochinolonům, …
K detekci se používají testy interakce specifických skupin antibiotik, např. DDST double disk synergy test, který prokazuje synergii mezi inhibitorem β-laktamázy a cefalosporinem 3. generace. Pozitivita se projeví deformací inhibičních zón.
8.2.5.3
Průkaz beta laktamáz typu AmpC
Tyto betalaktamázy rozkládají peniciliny, cefalosporiny I. – III. generace, monobaktamy. Geny rezistence jsou lokalizovány převážně chromozomálně, projevují se v přítomnosti induktoru (např. jiného antibiotika).
8.2.5.4
MRSA – Methicilin rezistentní Staphylococcus aureus
Tyto kmeny S. aureus jsou rezistentní k oxacilinu (methicilinu). Jejich průkaz se provádí na komerční chromogenní kultivační půdě s cefoxitinem a průkazem rezistence k cefoxitinu (diskově, dilučně).
8.2.5.5
VRE – Vankomycin rezistentní enterokoky
Zde se prokazuje rezistence k vankomycinu (diskově, dilučně) růstem na půdě s vankomycinem.
8.2.5.6
Současná rezistence k makrolidům a linkosamidům
Prokazuje se inducibilní (indukovaná) rezistence, která se projeví deformací zóny při spolupůsobení makrolidu a linkosamidu.
8.2.5.7
Další typy rezistence
Speciální problematiku u gramnegativních bakterií tvoří např. metalobetalaktamázy nebo karbapenemázy, …