14.2
Speciální klinická enzymologie
14.2.1
Aminotransferázy
Aminotransferázy (dřívějším, někdy dosud užívaným názvem transaminázy) katalyzují přenos aminoskupiny z aminokyseliny na ketokyselinu a naopak. V diagnostice se užívá stanovení aktivity dvou aminotransferáz; jsou to alaninaminotransferáza (ALT) a aspartátaminotransferáza (AST).
Tyto enzymy katalyzují následující reakce:
(1) alanin + 2-oxoglutarát → pyruvát + glutamát (katalyzuje ALT)
(2) aspartát + 2-oxoglutarát → oxalacetát + glutamát (katalyzuje AST)
Spektrofotometrické stanovení aktivity aminotransferáz vychází z výše uvedených reakcí; na ně navazuje další reakce, kdy je vzniklá ketokyselina redukována koenzymem NADH na příslušnou hydroxykyselinu. Měříme úbytek absorbance v UV světle – optimální vlnová délka je 340 nm. Redukovaná forma koenzymu totiž absorbuje světlo uvedené vlnové délky, zatímco vznikající oxidovaná forma NAD+ nikoliv. Protože aminotransferázy potřebují koenzym pyridoxalfosfát (derivát vitaminu B6), je tato látka součástí reakční směsi.
Na rovnici (1) navazuje:
Na rovnici (2) navazuje:
oxalacetát + NADH + H+ → malát + NAD+ (katalyzuje malátdehydrogenáza, MD)
ALT je čistě cytoplazmatický enzym, nejvyšší aktivitu najdeme v hepatocytech. AST se vyskytuje nejen v játrech, ale ve vysoké aktivitě ji najdeme i v kosterním a srdečním svalu, méně i v jiných parenchymatózních orgánech. Poměrně vysoká aktivita AST je v erytrocytech, proto při stanovení vadí hemolýza. Jaterní buňka má jen asi 35 % AST v cytoplazmě, zbytek je v mitochondriích. Cytoplazmatická frakce se uvolňuje do krve velmi snadno i při mírném poškození hepatocytů. Mitochondriální AST naproti tomu přechází do krve až při nekróze jaterní buňky. Poměr AST/ALT má tedy význam pro určení závažnosti poškození hepatocytů.
+
Umístění aminotransferáz AST a ALT v jaterní buňce
Aktivita ALT stoupá při poškození jater: akutní virová hepatitida (stoupá už týden před ikterem), infekční mononukleóza, toxické poškození jater, sepse aj. Krátkodobý vzestup ALT pozorujeme po požití většího množství alkoholu. Je-li poškození buněk těžké, je poměr AST/ALT vyšší než 1; bývá to u pacientů s aktivní cirhózou a metastázami do jater.
U poškození myokardu (srdeční infarkt) nebo onemocnění kosterních svalů (svalová dystrofie, po zhmoždění svalů, při otravě oxidem uhelnatým, v šoku, ale i po extrémní fyzické námaze) stoupá především AST. Svalový původ zvýšené aktivity AST v krevním séru potvrdí i nález zvýšené aktivity kreatinkinázy (CK) a koncentrace myoglobinu.
14.2.2
Kreatinkináza (CK)
Katalyzuje vratnou fosforylaci kreatinu:
kreatin + ATP ↔ kreatinfosfát + ADP
Má tedy význam pro energetický metabolismus svalu. Nachází se v příčně pruhovaných svalech (myokard, kosterní svaly), dále v mozkové tkáni.
Při stanovení CK probíhá výše uvedená reakce opačným směrem a navazují další dvě reakce; nakonec se měří přírůstek NADPH jako nárůst absorbance při vlnové délce 340 nm:
kreatinfosfát + ADP → kreatin + ATP (katalyzuje kreatinkináza)
ATP + glukóza → ADP + glukóza-6-fosfát (katalyzuje hexokináza)
glukóza-6-fosfát + NADP+ → kyselina 6-fosfoglukonová + NADPH + H+ (katalyzuje glukóza-6-fosfátdehydrogenáza)
Kreatinkináza je dimer, skládající se ze dvou podjednotek, které jsou dvojího typu: M (muscle) a B (brain). Kombinací těchto podjednotek vznikají tři izoenzymy CK: MM, MB a BB. Izoenzym BB se vyskytuje v mozku a v krvi ho najdeme jen velmi vzácně. Izoenzym MM nacházíme v kosterním i srdečním svalu. Izoenzym MB je rovněž obsažen v obou typech příčně pruhovaného svalu; mnohem více je však zastoupen v srdečním svalu.
Zvýšení aktivity CK v séru najdeme při onemocnění kosterních svalů: progresivní svalová dystrofie, ale i intramuskulární injekce, resuscitace, křeče, šok (extrémní zvýšení) aj. Aktivita CK stoupá i po dlouhotrvajícím svalovém výkonu, zejména u netrénovaných jedinců. Dříve se stanovoval izoenzym CK-MB při diagnostice srdečního infarktu; nyní je nahrazen stanovením specifičtějšího kardiálního troponinu T nebo I.
14.2.3
Laktátdehydrogenáza (LD)
Katalyzuje reverzibilní přeměnu pyruvátu na laktát, tedy poslední reakci anaerobní glykolýzy:
pyruvát + NADH + H+ ↔ laktát + NAD+
Tato reakce se užívá i při stanovení aktivity LD (sleduje se přeměna NAD+ na NADH při oxidaci laktátu na pyruvát spektrofotometricky v UV světle).
Jde o poslední reakci anaerobní glykolýzy; to vysvětluje nález LD prakticky ve všech tkáních, velmi vysokou aktivitu najdeme v játrech, svalech a především v erytrocytech; aktivita LD stoupá v krevním séru při intravaskulární hemolýze. Měření LD má význam pro klasifikaci a stanovení prognózy některých maligních nádorů; vysoká aktivita LD je výrazem zisku energie anaerobní glykolýzou.
LD je tetramer, složený ze dvou typů podjednotek (H a M); rozeznáváme pět izoenzymů, jejichž stanovení se však již neužívá.
14.2.4
Alfa-amyláza (AMS)
Katalyzuje štěpení škrobu, resp. α-1,4-glykosidických vazeb mezi molekulami glukózy ve škrobu.
Amyláza je produkována především žlázami gastrointestinálního ústrojí (slinné žlázy, slinivka břišní). Enzymy tvořené slinnými žlázami a pankreatem se dají odlišit, známe slinnou (S) a pankreatickou (P) amylázu.
Substrát pro stanovení α-amylázy obsahuje 4-nitrofenol, který je vázán na oligosacharid, tvořený obvykle sedmi molekulami glukózy spojenými α-1,4-glykosidickými vazbami jako ve škrobu (maltoheptaosid). Substrát je hydrolyzován α-amylázou na kratší štěpy, z nichž v činidle přítomná α-glukosidáza odštěpí 4-nitrofenol; jeho žluté zabarvení se měří spektrofotometricky. Štěpení celého substrátu α-glukosidázou brání chemická modifikace volného konce oligosacharidového řetězce.
Amyláza má poměrně malou molekulu, a proto se jako jeden z mála enzymů dá prokázat v moči. Vzhledem k zahuštění moči bývá aktivita AMS (alfa-amyláza) v moči dokonce vyšší než v séru.
Zvýšení aktivity AMS v krevním séru najdeme u poškození produkujících žláz. Zásadní význam má její stanovení při podezření na akutní pankreatitidu, kdy aktivita v séru i moči je významně zvýšená. Mírné zvýšení (pouze v séru) najdeme u selhání ledvin a u tzv. makroamylazémie – enzym je vázán na imunoglobulin a v krvi se hromadí vzniklý makromolekulární komplex, který je tak velký, že neprochází glomeruly.
Poznámka
Je to enzym katalyzující hydrolýzu monoesterů kyseliny fosforečné v alkalickém prostředí. Největší aktivitu najdeme v játrech (především ve žlučových cestách), osteoblastech, buňkách střevní sliznice a placenty. Její význam v organismu není zcela objasněn; enzym produkovaný osteoblasty se uplatňuje při mineralizaci kostní tkáně.
Při spektrofotometrickém stanovení se využívá hydrolýza umělého substrátu, 4-nitrofenylfosfátu; uvolněný 4-nitrofenol má intenzivně žluté zbarvení:
4-nitrofenylfosfát + H2O → 4-nitrofenol + fosfát
Rozlišujeme izoenzymy ALP, nejdůležitější je rozlišení kostní a jaterní ALP. K jejich stanovení se obvykle užívá vazba kostní ALP na speciální lektin v kombinaci s elektroforézou či finančně náročnější imunochemická metoda.
Příčiny zvýšení aktivity v séru zahrnují především uzávěr žlučových cest (jaterní izoenzym) a onemocnění kostí – nádory kostí a metabolická onemocnění včetně nedostatku vitaminu D (křivice, osteomalacie). Fyziologické zvýšení aktivity najdeme u dětí jako výraz osteoblastické aktivity při růstu kostí a v třetím trimestru těhotenství, kdy se do krve vyplavuje izoenzym z placenty.
Poznámka
Kyselá fosfatáza (ACP) katalyzuje stejnou reakci jako fosfatáza alkalická, ale v kyselém prostředí. ACP v osteoklastech se uplatňuje při kostní resorpci. ACP rezistentní k inhibici tartarátem se někdy stanovuje jako izoenzym produkovaný osteoklasty. V daleko nejvyšší aktivitě se ACP nachází v prostatě. Při diagnostice karcinomu prostaty byla však nahrazena specifičtějším prostatickým specifickým antigenem (PSA).
14.2.6
Gama-glutamyltransferáza (GGT)
Je to enzym, který katalyzuje přenos γ-glutamylového zbytku na vhodný akceptor (např. peptid či bílkovinu). Zdá se, že má význam pro udržení intracelulární koncentrace důležitého antioxidantu glutathionu. Je obsažena především v játrech a buňkách žlučovodů.
Spektrofotometrické stanovení využívá uvolnění žlutého 4-nitro-3-karboxyanilinu z umělého substrátu:
γ-glutamyl-4-nitro-3-karboxyanilid + glycylglycin → γ-glutamylglycylglycin + 4-nitro-3-karboxyanilin
Zvýšení aktivity GGT pozorujeme u toxického poškození jater (např. u alkoholiků), u obstrukce žlučových cest a často i při postižení jater metastázami. Fyziologicky je vyšší aktivita GGT u mužů.
14.2.7
Cholinesteráza (CHS)
Rozeznáváme acetylcholinesterázu (ACHS), která hydrolyzuje selektivně acetylcholin; vytváří se v synapsích motorických nervů a parasympatiku. Příbuzný enzym, zvaný někdy též pseudocholinesteráza, štěpí i jiné estery cholinu. Vzniká v játrech a je secernován do krve.
Stanovení pseudocholinesterázy spočívá v hydrolýze umělého substrátu butyrylthiocholinu; –SH skupina uvolněného thiocholinu se stanovuje barevnou reakcí s kyselinou 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoovou:
butyrylthiocholin + H2O → butyrát + thiocholin
Patologické je snížení aktivity CHS v séru. Pozorujeme ho u poruchy proteosyntézy při selhání jater, ale i při proteinové malnutrici. Další příčinou je intoxikace organofosfáty, které představují non-kompetitivní inhibitory tohoto enzymu (bojové chemické látky, ale i některé insekticidy). Vzácný je hereditární deficit CHS, který se projeví zpomalením metabolismu suxamethonia, léku podávaného jako myorelaxans.
14.2.8
Referenční hodnoty základních enzymů
Následující tabulka shrnuje referenční hodnoty enzymů, běžně stanovovaných v klinicko-biochemických laboratořích.
Referenční hodnota běžně stanovovaných enzymů (platí pro dospělé osoby středního věku); *děti a těhotné v posledním trimestru mají vyšší hodnoty; **závisí na druhu substrátu
Enzym | Referenční hodnoty | Enzym | Referenční hodnoty | Enzym | Referenční hodnoty |
ALP | 0,7 – 2,2 µkat/l * | CK | muži < 3,2 µkat/l | CHS | muži > 88 µkat/l |
ALT | < 0,7 µkat/l | ženy < 2,4 µkat/l | ženy > 72 µkat/l | ||
AMS | < 1,5 µkat/l ** | GGT | muži < 1,2 µkat/l | LD | < 4,2 µkat/l |
AST | < 0,8 µkat/l | ženy < 0,7 µkat/l |
Souhrn
Prvá polovina kapitoly shrnuje stručně poznatky z obecné enzymologie (substrát a produkt, specifičnost enzymové reakce, faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce, zásady stanovení katalytické koncentrace enzymů a užívané jednotky, stanovení enzymů jakožto antigenů, pojem izoenzymy, makroenzymy, proenzymy, enzymové stanovení substrátů). Druhá část je speciální enzymologie: systematicky probírá diagnosticky důležité enzymy podle jednotného schématu: katalyzovaná reakce a místo enzymu v metabolismu, obsah ve tkáních, metody a význam stanovení. V závěru jsou v tabulce shrnuty referenční hodnoty běžně stanovovaných enzymů.
Student vysvětlí pojmy specifičnost enzymové reakce, aktivátory, inhibitory (včetně rozdílu mezi kompetitivními a non-kompetitivními inhibitory), definuje katal a mezinárodní jednotku a popíše obecné zásady stanovení katalytické koncentrace enzymů. Charakterizuje pojem izoenzymů, makroenzymů, proenzymů a na příkladech demonstruje užití enzymů při stanovení koncentrace substrátů. U všech diagnosticky významných enzymů uvede reakci, kterou katalyzují, a popíše metody a diagnostický význam stanovení.
Kompetitivní inhibitory
Vysoký poměr AST/ALT (> 1)
Obstrukční žloutenka vede ke zvýšené sérové aktivitě
Zvýšenou aktivitu α-amylázy v séru pozorujeme u
Sníženou aktivitu cholinesterázy pozorujeme u